抗体表达的效率取决于遗传物质递送、细胞存活以及后续的蛋白合成与分泌。随着双特异性抗体及多链抗体构型的发展，电转染的优化需要同时关注这些相互关联的过程。双压多脉冲电转仪（Double Voltage Multipulse Electroporator，DVMPE）通过组合高压、低压及多脉冲序列，为不同细胞和表达体系提供更灵活的参数调控方式。本文围绕其作用机制、电场关系和产量评价展开讨论，并介绍现有实验结果。
一、从膜通透化到蛋白表达
电转染利用外加电脉冲改变细胞膜两侧的电位差，使细胞膜通透性暂时增加。在质粒DNA递送过程中，电场还通过电泳作用促进DNA接近细胞膜并与膜发生相互作用。膜通透化、DNA内化、胞内运输及入核共同影响最终的基因表达，不能将整个过程等同于脉冲期间的瞬时穿孔。[1,3]
对于常规哺乳动物细胞的质粒表达体系，DNA通常需要进入细胞核完成转录，随后mRNA在细胞质中翻译。分泌型抗体还要经历折叠、链装配及分泌过程。因此，瞬时转染并不是质粒仅在细胞质中发挥作用，而是外源遗传信息未被长期稳定维持；稳定转染则通常涉及基因组整合或特定的稳定游离维持机制，并通过筛选与稳定性评价建立持续表达体系。
高压短脉冲和低压较长脉冲分别侧重膜通透化与DNA电泳运输，但其作用存在联系。文献研究表明，组合方案的收益受到质粒浓度、细胞状态及培养组织形式等因素影响：在部分低质粒浓度条件下，低压脉冲能够增加转染；在质粒浓度充足或其他脉冲方案已获得较好效果的条件下，增加低压阶段并不必然带来进一步提升。[1,2]
二、用独立参数描述电转方案
电转仪的技术能力应以实际可控制的参数及其输出性能描述。电压、脉宽和脉冲数属于输入参数，蛋白表达量属于输出指标。双压多脉冲方案的主要控制参数可表示为：
θ = (Uₕ, tₕ, nₕ, Uₗ, tₗ, nₗ, Δtₕ, Δtₗ, Δtₕₗ, s)。
其中，U、t、n分别表示电压幅值、单脉冲宽度和脉冲数量；下标h、l分别对应高压和低压阶段；Δtₕ、Δtₗ表示各阶段脉冲间隔，Δtₕₗ表示高低压阶段间隔；s表示极性与时序。参数之间存在硬件约束或程序绑定时，实际独立调节的自由度相应减少。
双压多脉冲的意义在于拓展可调参数组合，使膜通透化、DNA运输与细胞存活得到协调。评价方案时，应同时考察目标蛋白产量、细胞活率、转染率及产品质量，而非只比较电压或脉冲数量。
三、电压、电场与处理细胞规模
在近似均匀的平行板电极体系中，电场强度E、实际负载电压U单位伏和电极间距d单位厘米满足：
E = U/d。
因此，相同电压在不同电极间距下对应不同场强。
处理细胞数满足N=cV，其中c为细胞密度，V为处理体积。规模扩大既可以通过改变电极结构实现，也可以通过增加细胞密度实现，细胞数量本身不能唯一确定所需电压，而是需要参考所需电场强度根据电极间距离d计算而来。对于近似欧姆负载，电阻R≈d/(σA)，其中σ为含细胞溶液电导率，其数值与细胞密度c成反比，A为电极有效面积。在保持场强的条件下，增大电极面积会增加电流，增加细胞浓度会降低电流，因此保持恒定的电极间距离和电极面积比例以及细胞浓度是电转体系等比例放大所要遵守的条件。
谋远已在等渗溶液条件下实现6000 V稳定放电，并连续四年实现“每12个月等渗溶液条件下电击电压上限提高1000 V”的规律，以目前技术储备看，未来这一规律何时失效还未知。这一进展扩展了设备的适应范围，使得用户可以利用等渗的无血清培养基做为电转缓冲液进行无浓缩直接电转，同时为大规模表达需求下双压放电中高压电场的实现提供了坚实的基础。未来谋远将在此基础上进行适应发酵罐的双压大体积流式电转和时速超过150管/小时的双压高速流水线电转设备的进一步研发迭代，以适应不同客户的需求。
四、蛋白产量的数学描述
蛋白产量是递送、存活、表达和培养过程共同作用的结果。以培养至时间T的累计分泌目标蛋白质量P(T)为评价对象，在忽略蛋白降解、吸附及取样损失的条件下，其收支关系为：
P(T) = ∫₀ᵀ Nᵥ(τ) · η(τ) · qₚ(τ) dτ。
其中，Nᵥ(τ)为时刻τ的活细胞数量，η(τ)为活细胞中有效表达目标蛋白的比例，qₚ(τ)为表达细胞的平均目标蛋白分泌速率，单位为质量/细胞/时间。该关系把产量分解为活细胞规模、有效表达比例和单细胞生产能力，并纳入培养时间。目标蛋白滴度则为相应蛋白质量与培养液体积之比。
电转参数通过影响这些生物学变量改变最终产量。通透性增加不等于表达比例必然增加；表达比例提高也不等于总产量必然提高，因为细胞损伤或单细胞生产能力下降会抵消递送收益。收获时的完整抗体产量还受降解、链装配及回收过程影响。
电场暴露可用于描述脉冲输入。在同方向、近似均匀的低压脉冲中，定义低压电场时间积分为：
Dₗ = Σⱼ Eₗ,ⱼtₗ,ⱼ。
当各低压脉冲幅值和宽度相同时，Dₗ=Eₗtₗnₗ。在迁移率μ近似恒定的自由电泳条件下，位移近似满足ℓ≈μDₗ。该关系描述电泳运输，不直接等同于跨膜递送效率或蛋白产量；膜结合、胞内运输及脉冲时序仍影响生物学结果。
电场暴露还伴随能量沉积。对于近似均匀、欧姆导电且电导率变化可忽略的介质，单位体积焦耳热沉积满足：
w ≈ σΣᵢEᵢ²tᵢ。
求和包括高压与低压全部脉冲；采用SI单位时，w的单位为J/m³。该关系表明，增加场强、脉宽或脉冲数既会改变运输过程，也会增加热负荷。因此，电转优化具有明确的条件约束，目标是在维持细胞存活和产品质量的同时提高产量，而不是无限增加某一个电学参数。
五、现有实验结果
现有实验采用高压电场强度800-1200 V/cm的设置，低压电场强度为200–300 V/cm，低压单脉冲宽度为15–30 ms，低压脉冲数为2-6个。在所测试的单抗、双抗及多链共转染实验中，在表达目的基因及培养体系所有其他条件相同的情况下与谋远公司生产的单电压电转相比，表达量提高了20%–30%，这一结果体现了双压多脉冲方案在所测试体系中的应用价值。
上述高压场强是本组实验的参数设置，不代表所有细胞达到该场强后均获得完全或等效的膜通透化。膜通透性、细胞活率和转染效果分别对应不同的生物学指标，需在具体体系中区分评价。
现阶段结果用于说明所测试条件下的表达量改善，在进一步的验证中，可能还有更优的方案进一步提高表达量。最佳参数组合、质粒减量效果，以及既往难表达构型的改善幅度属于后续研究内容，需要做进一步的验证才能确定最大提升幅度及难转染项目的提升效果。
六、面向复杂抗体表达的技术方向
双压多脉冲电转的研发重点，是通过电场幅值、脉宽、脉冲数量和时序的协同调控，提高递送与培养过程的综合效率。设备输出能力为参数优化提供工程基础，产量与质量评价则确定技术的实际价值。对于双特异性抗体、多链抗体以及AI辅助研发的候选蛋白，递送只是表达流程中的一个环节。
由于双压电转对细胞造成的损伤更小，细胞活率及转染效率都很高，理论上可以瞬转结束后直接铺板挑单克隆，可以将稳转株构建时间缩短1个月以上。
AlphaFold等方法用于结构及相互作用预测[4]，蛋白的合成、折叠、装配和功能仍由具体表达体系与实验结果检验。DVMPE的发展方向，是将可控的电转参数与明确的生物学终点连接起来，为复杂蛋白表达提供可优化的技术工具。
参考文献
[1] Kandušer M, Miklavčič D, Pavlin M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high- and low-voltage pulses—An in vitro study. Bioelectrochemistry, 2009, 74(2): 265–271. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2008.09.002.
[2] de Caro A, Bellard E, Kolosnjaj-Tabi J, Golzio M, Rols MP. Gene Electrotransfer Efficiency in 2D and 3D Cancer Cell Models Using Different Electroporation Protocols: A Comparative Study. Pharmaceutics, 2023, 15(3): 1004. DOI: 10.3390/pharmaceutics15031004.
[3] Pavlin M, Kandušer M. New Insights into the Mechanisms of Gene Electrotransfer—Experimental and Theoretical Analysis. Scientific Reports, 2015, 5: 9132. DOI: 10.1038/srep09132.
[4] Abramson J, et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature, 2024, 630: 493–500. DOI: 10.1038/s41586-024-07487-w.
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